本文引用：于妍,王春愛,秦曉宇,李玉蘭,梁曦,溫曉輝,劉敏.穴位注射葛根素對(duì)布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機(jī)制研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2022,25(18):2280-2285.DOI:10.12114/j.issn.100

本文引用：于妍, 王春愛, 秦曉宇, 李玉蘭, 梁曦, 溫曉輝, 劉敏. 穴位注射葛根素對(duì)布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機(jī)制研究[J]. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué), 2022, 25(18): 2280-2285. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.143

Yan YU, Chunai WANG, Xiaoyu QIN, Yulan LI, Xi LIANG, Xiaohui WEN, Min LIU. Effect and Mechanism of Action of Acupoint Injection of Puerarin on Myocardial Mitochondria Energy metabolism in Bupivacaine-poisoned Rats[J]. Chinese General Practice, 2022, 25(18): 2280-2285. DOI: 10.12114/j.issn.1007-9572.2021.02.143

穴位注射是在傳統(tǒng)針灸基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種療效顯著的中西醫(yī)結(jié)合療法，其以經(jīng)絡(luò)學(xué)說為指導(dǎo)，將腧穴、經(jīng)絡(luò)、藥效有機(jī)結(jié)合，兼具針刺和藥物的治療作用，具有用藥劑量小、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，還能大幅度提升臨床療效。近年來穴位注射方法在輔助麻醉及心律失常治療領(lǐng)域上廣泛應(yīng)用[1,2]。

布比卡因是一種長(zhǎng)效的酰胺類局麻藥，因其常規(guī)劑量下使用相對(duì)安全，且起效快速，常被用于各類手術(shù)[3]。然而，過量使用或誤入靜脈仍會(huì)導(dǎo)致心律失常、心肌收縮力降低以及循環(huán)衰竭從而引發(fā)心臟驟停[4]。臨床常用針刺輔助麻醉以減少布比卡因所需劑量，從而避免其不良反應(yīng)[5]。內(nèi)關(guān)穴是治療心血管疾病的常用穴位之一，刺激內(nèi)關(guān)穴具有抗心律失常、減輕心肌損傷的作用[6]。大量研究表明葛根素具有明顯的心臟保護(hù)作用[7]。本研究旨在探討穴位注射葛根素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷的影響及其可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及時(shí)間

6月齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（280±20）g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK[甘]2019-0002）。本實(shí)驗(yàn)遵循美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用指南》，并經(jīng)甘肅省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)2019-005）。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019年1—12月。

1.2　藥品與試劑

鹽酸布比卡因注射液購(gòu)自上海朝輝藥業(yè)有限責(zé)任公司（批號(hào)：1404113），葛根素注射液購(gòu)自成都天臺(tái)山制藥有限公司（批號(hào)：180201），JC-1試劑盒購(gòu)自Beyotime公司，大鼠三磷酸腺苷合成酶（ATPase）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自Elab Science公司，三磷酸腺苷（ATP）ELISA試劑盒、Anti-過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）購(gòu)自Abcam公司，Anti-核呼吸因子（NRF1）、Anti-線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA）購(gòu)自GeneTex公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)儀器

鼠控溫解剖臺(tái)（眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司），微量注射泵（圣諾醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司，SN-50F6），多道電生理記錄儀（AD instruments，DBS-170），Power Lab數(shù)據(jù)采集及分析系統(tǒng)（埃德儀器國(guó)際貿(mào)易公司），精密電子天平（Sartorius公司），高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司），-80 ℃超低溫冰箱（Form scientific公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Thermo公司）。

1.4　動(dòng)物分組與給藥方法

采取隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白組（C組）、模型組（B組）、治療組（T組）、預(yù)防組（P組），每組10只。P組：雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴分別注入0.1 ml的葛根素注射液。5 min后開始建立布比卡因中毒模型（C組除外），建模方法參照文獻(xiàn)[8,9]，經(jīng)10%水合三氯乙醛麻醉后，經(jīng)股靜脈2 min內(nèi)靜脈滴注0.5%布比卡因10 mg/kg，Ⅱ?qū)?lián)心電圖出現(xiàn)心律失常（頻發(fā)室性期前收縮、室性心動(dòng)過速、QRS延長(zhǎng)20%）表明模型建立成功。將1根套管針置于右側(cè)頸動(dòng)脈以采集血樣及監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓，將另1根套管針置于左側(cè)股靜脈以術(shù)中給藥，并鏈接PowerLab系統(tǒng)；術(shù)中持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠外周血壓及Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

C組不建模，于雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴（大鼠前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm尺橈骨縫間）分別注入0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液。B組：建模成功后即刻取雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴分別注入0.1 ml 0.9%氯化鈉溶液。T組：建模成功后即刻取雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴分別注入0.1 ml葛根素注射液。C組在靜脈滴注0.9%氯化鈉溶液的第8分鐘，B組、T組、P組分別在靜脈滴注利多卡因的第8分鐘處死大鼠，提取所有大鼠左室心肌，分離心肌細(xì)胞線粒體。

1.5　指標(biāo)測(cè)定

1.5.1　透射電鏡

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)大鼠實(shí)施安樂死，并逆行灌注，提取左室心肌，-80 ℃保存。心肌細(xì)胞勻漿，冷凍高速離心，2 000 r/min離心10 min（離心半徑5 cm）。取上清液，10 000 r/min離心15 min（離心半徑5 cm），分離心肌細(xì)胞線粒體，采用透射電鏡觀察線粒體的結(jié)構(gòu)。

采用Flameng評(píng)分法評(píng)價(jià)線粒體半定量結(jié)構(gòu)，每個(gè)電鏡標(biāo)本隨機(jī)選擇若干個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野中的線粒體按此法將線粒體的改變分為5級(jí)，并按等級(jí)記分；0級(jí)（0分）：正常超微結(jié)構(gòu)的線粒體，顆粒完整；Ⅰ級(jí)（1分）：結(jié)構(gòu)基本正常，部分顆粒丟失；Ⅱ級(jí)（2分）：線粒體腫脹，基質(zhì)透明；Ⅲ級(jí)（3分）：基質(zhì)透明，線粒體嵴斷裂或基質(zhì)中出現(xiàn)絮狀凝集；Ⅳ級(jí)（4分）：基質(zhì)丟失，線粒體嵴斷裂，外膜不完整。

1.5.2　ELISA法

采用ELISA法檢測(cè)心肌細(xì)胞ATPase活性。組織樣品在磷酸鹽緩沖液中勻漿后，離心獲得上清液，37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)記劑沖洗、孵育、顯色。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)量各孔的吸光度，并記錄。

1.5.3　比色法

采用磷鉬酸比色法測(cè)定線粒體ATP含量。將心肌組織裂解，4 ℃下12 000×g離心5 min，收集上清液，用分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4　熒光比色法

采用JC-1試劑盒測(cè)量線粒體膜電位（MMP）。將1×JC-1工作液按適當(dāng)比例加入純化的線粒體中，激發(fā)波長(zhǎng)為458 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm，用熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.5　Western blotting法

心肌組織樣品勻漿后取上清液，分離蛋白，測(cè)定總蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，而后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用一抗、二抗在37 ℃下分別孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法獲得Western blotting圖像。采用Image J軟件對(duì)靶蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，記錄PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（

±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　不同處理對(duì)大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1　大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)電鏡觀察

C組大鼠心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量豐富，顆粒完好呈卵圓形，包膜完整，嵴連續(xù)；B組大鼠心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量減少、分布不勻，部分線粒體體積變小、形態(tài)改變、線粒體膜完整性被破壞，少量線粒體嵴斷裂缺失；T組大鼠心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量略減少，個(gè)別線粒體變形、線粒體嵴斷裂缺失；P組大鼠心肌細(xì)胞線粒體數(shù)量較豐富，顆粒完整，部分線粒體嵴紊亂，無斷裂缺失（圖1）。

2.1.2　大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷情況

四組大鼠Flameng評(píng)分法得分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中B組、T組、P組大鼠Flameng評(píng)分法得分高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組大鼠Flameng評(píng)分法得分低于B組、T組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2　不同處理對(duì)心肌線粒體功能障礙的影響

四組大鼠ATPase活性、ATP含量、MMP比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

B組、T組大鼠ATPase活性低于C組、P組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組、T組、P組大鼠ATP含量、MMP低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組、P組大鼠ATP含量、MMP高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3　不同處理對(duì)心肌線粒體PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白表達(dá)的影響

四組大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。B組、T組、P組大鼠PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組、P組大鼠PGC-1α蛋白水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組大鼠NRF1蛋白水平高于B組、T組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；T組、P組大鼠mtTFA蛋白水平高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P組大鼠mtTFA蛋白水平高于T組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3、圖2。

3　討論

布比卡因是臨床工作中廣泛使用的麻醉藥物，但其具有嚴(yán)重的心臟毒性。目前，應(yīng)用最多的解毒方法是使用脂肪乳劑，但同時(shí)也存在許多爭(zhēng)議。因此，尋找一種更加安全、有效的救治布比卡因心臟毒性的方法具有重要意義。針灸因其簡(jiǎn)便易行、價(jià)廉、安全等諸多特點(diǎn)在麻醉領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視，但對(duì)于針灸對(duì)抗麻醉藥心肌毒性方面的研究還處于起步階段。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明穴位處理為治療布比卡因所引起的心臟毒性提供了一定理論依據(jù)[9]，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。近年對(duì)于布比卡因心肌毒性的研究主要集中在對(duì)線粒體損傷及能量代謝障礙方面，本研究將利用現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從亞細(xì)胞器水平出發(fā)，全面探討穴位預(yù)處理對(duì)抗布比卡因中毒大鼠心肌線粒體損傷及能量代謝障礙的作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，為中醫(yī)藥防治布比卡因心肌毒性的研究提供新思路。

線粒體通過電子傳遞和氧化磷酸化為真核細(xì)胞提供能量[10]，若以上過程發(fā)生障礙，則會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量減少。ATP產(chǎn)生一旦減少，呼吸鏈電子漏出的活性氧（ROS）隨即增加，導(dǎo)致MMP降低、通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，線粒體內(nèi)外膜的通透性與完整性發(fā)生變化，進(jìn)而影響其形態(tài)結(jié)構(gòu)，形態(tài)結(jié)構(gòu)改變后又會(huì)加重線粒體的功能異常，形成惡性損傷循環(huán)[11]。有研究顯示，布比卡因引起心臟毒性的機(jī)制之一是其損傷心肌細(xì)胞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能。布比卡因可使線粒體的體積增大、數(shù)量減少[12]，呈空泡或髓樣改變[13]；還可降低部分線粒體呼吸鏈復(fù)合體的活性，導(dǎo)致電子傳遞障礙，影響線粒體能量代謝、產(chǎn)能減少[14,15]，促進(jìn)線粒體中ROS的產(chǎn)生[16]，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

PGC-1α是線粒體能量代謝的關(guān)鍵因子[17,18,19]，PGC-1α與NRF1結(jié)合后，激活mtTFA活性，控制線粒體DNA（mtDNA）的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，調(diào)控ATPase等線粒體基因組編碼呼吸鏈亞基的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組、T組大鼠ATPase活性低于C組，B組、T組、P組大鼠ATP含量、MMP及PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白水平低于C組，表明布比卡因可抑制PGC-1α、NRF1、mtTFA蛋白的表達(dá)，降低ATPase活性，減少ATP合成，使線粒體MMP下降，導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)損害，產(chǎn)生心肌毒性。

既往研究表明，內(nèi)關(guān)穴的心肌保護(hù)作用主要通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝的各種信號(hào)來實(shí)現(xiàn)[20]。從中藥葛根中分離的葛根素通過靶向作用線粒體亦顯示出對(duì)心肌的保護(hù)作用[21]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)關(guān)穴注射葛根素減輕布比卡因?qū)е麓笫笮呐K毒性的機(jī)制與其增加心肌組織中的乳酸脫氫酶（LDH）活性、增加Na+-K+-ATPase活性、調(diào)節(jié)線粒體能量代謝有關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，P組大鼠ATPase活性高于B組、T組，T組、P組大鼠ATP含量、MMP高于C組；T組、P組大鼠PGC-1α蛋白水平高于B組，P組大鼠NRF1蛋白水平高于B組、T組，T組、P組大鼠mtTFA蛋白水平高于B組，P組大鼠mtTFA蛋白水平高于T組；表明通過穴位注射葛根素可以逆轉(zhuǎn)布比卡因造成的線粒體結(jié)構(gòu)及功能損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞，且注入布比卡因前預(yù)先穴位注射葛根素對(duì)線粒體的調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于注入布比卡因出現(xiàn)心律失常后再穴位注射葛根素。但因本實(shí)驗(yàn)未設(shè)立相關(guān)蛋白分子的激動(dòng)劑和抑制劑組，所以難以得出因果關(guān)系，這也是今后本課題組進(jìn)一步研究的方向。

綜上所述，穴位注射葛根素可減輕布比卡因致心肌線粒體損傷，可能與其調(diào)節(jié)PGC-1α/NRF1/mtTFA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、保護(hù)線粒體能量代謝、減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

本文無利益沖突。

本文部分圖表略

參考文獻(xiàn)略

穴位注射葛根素對(duì)布比卡因中毒大鼠心肌線粒體能量代謝的影響及其機(jī)制研究