2021年7月，美國基因療法公司AdverumBiotechnologiesInc.（NASDAQ:ADVM，Adverum）暫停了其AAV基因治療藥物ADVM-022用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變黃斑水腫（DME）的II期臨床試驗，原因是一例

2021年7月，美國基因療法公司Adverum Biotechnologies Inc.（NASDAQ:ADVM，Adverum）暫停了其AAV基因治療藥物ADVM-022用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變黃斑水腫（DME）的II期臨床試驗，原因是一例受試者在接受單次高劑量治療30周后，出現(xiàn)了眼壓過低、炎癥以及失明等嚴重不良反應(yīng)，引發(fā)了業(yè)界對該藥物安全性的擔憂。

ADVM-022是一種使用Adverum專有載體衣殼AAV2.7m8的基因療法。該療法通過眼部單次玻璃體內(nèi) (IVT) 注射進行，旨在使視網(wǎng)膜內(nèi)細胞持續(xù)產(chǎn)生長久的治療和預(yù)防的效力，減輕頻繁注射抗VEGF抗體藥物的負擔，最終改善患者視力。

盡管面對臨床安全挑戰(zhàn)，基因療法仍然具有不可比擬的治療優(yōu)勢，尤其是對于缺少替代療法的單基因遺傳疾病來說。因為該療法能從根本上補充或修復(fù)缺陷基因，恢復(fù)健康基因的正常生物學功能，在患者中最大限度地減少甚至消除影響一生的癥狀。

近五年，眼部基因療法臨床試驗也在迅速增加，針對多種罕見遺傳性視網(wǎng)膜疾病和基因突變角膜疾病，比如無脈絡(luò)膜血癥、Leber遺傳性視神經(jīng)病變、Stargardt 病、X連鎖視網(wǎng)膜劈裂和X連鎖視網(wǎng)膜色素變性等。更值得期待的是，基因治療為遭受如AMD（老年性黃斑病變）等常見眼部疾病的病人（數(shù)億人）帶來希望。因為常規(guī)的VEGF抗體注射療法需要長期頻繁和定期的玻璃體內(nèi)注射，嚴重降低了患者依從性，也增加了治療風險。而基因療法正在成為其行之有效的治療方案。

正在進行的遺傳性視網(wǎng)膜疾病基因治療臨床試驗（部分），圖源：Paul Yang，AAO 2020

重組AAV基因載體（rAAV）治療眼部疾病的優(yōu)勢

在基因治療中，病毒載體技術(shù)是目前主要的基因?qū)敕绞?，該技術(shù)的進步很大程度上驅(qū)動著基因治療領(lǐng)域的發(fā)展。近二十年來，腺相關(guān)病毒 (AAV) 載體掀起了該領(lǐng)域的臨床熱潮。

AAV是一種小型無包膜細小病毒，作為遞送系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢，比如無致病性、高效持續(xù)表達、易于操作以及免疫原性低等。AAV載體攜帶的治療基因（gene of interest，GOI）進入細胞后，將轉(zhuǎn)錄翻譯為功能蛋白，達到治療一系列疾病的目的。

rAAV是眼部基因治療的主要載體，在治療性基因遞送中，AAV單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）基因組中編碼調(diào)節(jié)蛋白(Rep)和結(jié)構(gòu)蛋白 (cap)脫氧核糖核酸（DNA）序列被所需的GOI表達盒所替換，稱為重組AAV (rAAV)。AAV外衣殼（capsid）可以幫助GOI靶向特定組織，迄今已在靈長類動物中鑒定出12種不同的AAV血清型，它們的衣殼成分不同，顯示出不同的細胞趨向性、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和免疫原性。血清型AAV1、2、4、5、6、7、8 和 9 都顯示出視網(wǎng)膜組織的趨向性。

在治療眼疾方面，基因療法有顯著優(yōu)勢，這是由眼疾的遺傳基礎(chǔ)和眼部隔室的獨特性所決定的。

由于眼睛的解剖結(jié)構(gòu)明確，物理空間封閉有限，這為局部給藥提供了獨特優(yōu)勢。血眼屏障有助于眼部免疫特權(quán)，針對基因治療產(chǎn)品的免疫反應(yīng)有限。而且，眼睛的視網(wǎng)膜細胞不再進行分裂，可允許持續(xù)的基因表達且不會整合入基因組。最主要的是一系列眼部疾病（包括遺傳性失明）的潛在遺傳因素已被鑒定出來。此外，近來相關(guān)動物模型的開發(fā)也讓眼科研究取得重大進展，有利于開展眼部基因治療試驗。

Spark Therapeutics公司的Luxturna?（voretigene neparvovec-rzyl）是首個獲批上市的用于治療眼部罕見病的基因治療產(chǎn)品，Luxturna能將RPE65基因的正?？截愞D(zhuǎn)導(dǎo)入視網(wǎng)膜色素細胞 （RPE），治療雙等位基因RPE65突變的Leber 先天性黑蒙（LCA2）。

Luxturna的獲批是眼部疾病基因療法發(fā)展的重要里程碑。該項目的成功驗證了基因療法概念的可行性，也證實其在恢復(fù)或保持視力方面的重要價值。

rAAV眼部基因治療的技術(shù)瓶頸和相應(yīng)解決方案

rAAV產(chǎn)品已顯示出作為基因治療藥物的廣闊應(yīng)用前景，目前全球已有超過200項基于rAAV的臨床試驗。然而，多項在研項目并不像在LCA2 患者中觀察到的那樣始終如一地轉(zhuǎn)化為臨床結(jié)果。

事實上，作為一種由病毒基因組和多種結(jié)構(gòu)蛋白組成的復(fù)雜生物制劑，rAAV產(chǎn)品的上游開發(fā)以及下游生產(chǎn)過程都面臨著許多技術(shù)挑戰(zhàn)。如何保證rAAV的活性功效并降低臨床使用劑量，是需要解決的關(guān)鍵問題。因此，在優(yōu)化生產(chǎn)純化的同時，設(shè)計改造AAV載體以提高rAAV產(chǎn)品與靶細胞的親和力，增強GOI效力也非常重要。

1、優(yōu)化衣殼設(shè)計，改進載體工具

當所用載體的靶向和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力有限，就不得不增加使用劑量以達到預(yù)期的臨床效果，但高劑量的病毒樣產(chǎn)品也代表混有更多的雜質(zhì)，增加誘發(fā)免疫反應(yīng)的風險。同時，高劑量藥物難以均衡轉(zhuǎn)導(dǎo)，不同細胞類型的轉(zhuǎn)基因表達水平也難以控制。

為了提高載體靶向性和特定細胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，一方面，工程化改造AAV衣殼是優(yōu)化遞送載體的關(guān)鍵領(lǐng)域。AAV產(chǎn)品的衣殼質(zhì)量和視網(wǎng)膜細胞趨向性是實現(xiàn)安全有效的眼部基因治療的重要特征。人們可以從天然分離株中提取AAV衣殼，也可通過合理設(shè)計、定向進化或計算機引導(dǎo)技術(shù)對衣殼進行改造。在UC Berkeley就職的教授David Schaffer是使用“直接進化”的先行者，其實驗室產(chǎn)生了現(xiàn)在應(yīng)用于Adverum公司ADVM-022的視網(wǎng)膜特性性的AAV2.7m8新型載體。同時他也是4DMT公司的科學創(chuàng)始人，4DMT現(xiàn)在使用直接進化的手段發(fā)現(xiàn)新型的AAV載體，并在多種疾病領(lǐng)域進行了基因治療的布局和開發(fā)，包括，眼科，心血管疾病，及呼吸系統(tǒng)疾病。

值得關(guān)注的是，AAV衣殼工程化技術(shù)也是華人科學家劉勝江和陳海峰聯(lián)合創(chuàng)立的Avirmax公司的研發(fā)重點。據(jù)官網(wǎng)介紹，Avirmax擁有獨特的AAV衣殼工程技術(shù)，其開發(fā)的rAAV與受體的結(jié)合更強，能夠穿透玻璃體內(nèi)限制膜（Inner limiting membrane, ILM），將GOI高效導(dǎo)入視網(wǎng)膜細胞，產(chǎn)生高于野生型AAV衣殼成百上千倍的濃度。Avirmax的rAVV產(chǎn)品可用于常見視網(wǎng)膜疾病，比如wAMD、DME、PCV以及十余種罕見視網(wǎng)膜疾病的治療。下圖是Avirmax的一種改造過的AAV衣殼的計算機模擬圖。

為了增加rAAV功效，人們還可以借助于基因工程和優(yōu)化等技術(shù)，增強AAV載體GOI的表達水平，以達到降低藥物使用量的目的。Avirmax公司正在使用這類轉(zhuǎn)基因增強表達技術(shù)，他們的數(shù)據(jù)顯示，該技術(shù)能夠顯著增強AAV治療載體中的GOI的表達（提高10倍）。

2、降低免疫原性，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)

AAV基因治療產(chǎn)品面臨的另一項挑戰(zhàn)是如何實現(xiàn)無雜質(zhì)載體生產(chǎn)的可擴展性和經(jīng)濟性。

AAV產(chǎn)品中的衣殼成分、載體基因組、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物或混雜污染物都有激活宿主免疫反應(yīng)的可能，導(dǎo)致治療失敗或炎癥失控。即使AAV載體具有相對的免疫特權(quán)，但仍然能在視網(wǎng)膜下空間引發(fā)細胞反應(yīng)。因此，AAV產(chǎn)品制造商必須改進生產(chǎn)技術(shù)，更好地純化產(chǎn)品并嚴格質(zhì)控。其產(chǎn)品具有低免疫原性。

理想的AAV生產(chǎn)系統(tǒng)需在確保足夠的病毒滴度的同時減少有害污染物，去除空殼或者錯誤DNA包裝的載體，盡可能地減少臨床風險。然而，目前還沒有從載體產(chǎn)品中去除錯誤DNA包裝的技術(shù)；如何在大規(guī)模生產(chǎn)時從產(chǎn)品中去除空殼也是一大難題。

事實上，大規(guī)模生產(chǎn)AAV產(chǎn)品是保證臨床需求和降低產(chǎn)品價格的關(guān)鍵一環(huán)。從目前的應(yīng)用系統(tǒng)來看，相比于三重轉(zhuǎn)染HEK293系統(tǒng)或者哺乳動物穩(wěn)定細胞系生產(chǎn)系統(tǒng)，Avirmax公司使用的桿狀病毒生產(chǎn)平臺具有顯著優(yōu)勢，是非常有吸引力的一種大規(guī)模臨床級載體生產(chǎn)策略。

該平臺利用昆蟲（草地夜蛾）細胞系 Sf9與兩種桿狀病毒表達載體共感染：一種桿狀病毒載體攜帶GOI及其在 ITR 區(qū)域之間的啟動子，另一種桿狀病毒載體編碼rep和cap基因。這個系統(tǒng)可快速生產(chǎn)高質(zhì)量和高滴度的AAV產(chǎn)品，降低宿主細胞DNA錯誤包裝，提供可靠的病原體安全保證，而且，在此基礎(chǔ)上可以較易實現(xiàn)產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。

3、選擇合適疾病模型

之前的研究表明，使用小型模式動物的AVV實驗在轉(zhuǎn)到大型模式動物之后，其轉(zhuǎn)染效率等結(jié)果出現(xiàn)了偏差。而且，一些模式動物中觀察到的效果難以在人體試驗中應(yīng)用和重現(xiàn)。由于新型AAV載體的這種不可預(yù)見性，有必要在開展AAV產(chǎn)品的臨床試驗之前使用大型模式動物，比如非人類靈長類動物模型（如食蟹猴或恒河猴）進行研究。據(jù)了解，Avirmax公司堅持盡早使用大動物體系，來驗證新型AAV載體的臨床轉(zhuǎn)化成功率。

除了模型物種的選擇，研究者還需要考慮選用模型的年齡，治療方式，以及跟進時間長短等因素。通過選擇更合適的體外疾病模型，可靠地模擬人類生理水平，以得出更安全有效的臨床劑量范圍。

4、克服預(yù)存免疫力，擴大患者適用人群

人類血清學研究顯示，由于之前接觸過野生型AAV，全球人群存在AAV中和抗體的流行率很高，大約67%的人有針對AAV1的抗體，72%有針對AAV2的抗體，40%有針對AAV血清型5至9的抗體。因此，AAV基因治療試驗首先需對受試者進行篩選，50%以上的患者可能會被排除試驗。此外，載體預(yù)存免疫原性也是AAV產(chǎn)品再給藥的主要挑戰(zhàn)，這一問題在體內(nèi)基因治療方面尤其突出。

為了讓更多的患者得到治療機會，開發(fā)能夠“逃避”中和抗體的AAV衣殼是解決辦法之一。最近，一種新興的方法引發(fā)了關(guān)注，為解決該問題提供了新思路。該方法利用的是在細菌中發(fā)現(xiàn)的酶（imlifidase），目前正在測試的有IdeS和IdeZ。這類酶可在使用AAV產(chǎn)品之前使用，它們能在短期內(nèi)降解血液中預(yù)存的抗AAV中和抗體，為AAV載體到達目的細胞創(chuàng)造一個臨時的時間窗口。

臨床試驗與審批的機遇和挑戰(zhàn)

總之，基因治療獲得成功的關(guān)鍵是在可控炎癥的劑量下保證足夠的GOI表達水平，否則就會導(dǎo)致療效降低或喪失，需重新給藥或引起局部組織損傷，甚至威脅生命。

基因治療的潛力剛剛開始顯現(xiàn)。作為一種新的治療方式，AAV基因治療仍處于發(fā)展早期階段。相較于其他積累了大量經(jīng)驗和知識的生物制品（比如治療性抗體、重組蛋白），人們對AAV病毒載體的生物學特征的理解尚有待加深。

就目前的研發(fā)市場來看，專注于眼部疾病基因治療的公司越來越多。然而，我們看到很多研發(fā)項目都是集中在管線沖刺上，真正在解決基礎(chǔ)科學問題方面的研發(fā)力度遠遠不夠。即使有些產(chǎn)品沖進臨床階段，也可能會遭遇各種安全效力的問題，造成無法挽回的后果。

針對這一問題，除了加強產(chǎn)品基礎(chǔ)研發(fā)的力度和深度，不斷完善與跟進的臨床監(jiān)管也同樣重要，以明確和規(guī)范基因治療產(chǎn)品的臨床期望。

● 2008年4月，F(xiàn)DA首次發(fā)布人類基因治療指南。同年7月，F(xiàn)DA公布關(guān)于人類基因治療的更新指導(dǎo)文件草案，概述了當前的監(jiān)管觀點；

● 2020年1月, FDA發(fā)布了視網(wǎng)膜疾病基因治療指南《Human Gene Therapy for Retinal Disorders》；

● 2021年9月30日，F(xiàn)DA發(fā)布了《行業(yè)指南草案：早期臨床研究中單一疾病多版本細胞或基因治療產(chǎn)品的研究（Studying Multiple Versions of a Cellular or Gene Therapy Product in an Early-Phase Clinical Trial：Draft Guidance for Industry》(詳見參考文獻10)。在這項最新指南中，F(xiàn)DA創(chuàng)新地提出了對某一疾病的IND中，可用多個不同版本細胞和基因產(chǎn)品進行臨床，并對有意實施這種臨床研究初步安全性和生物活性的評估提供了多項建議，包括如何組織和構(gòu)建 IND、提交新信息和報告不良事件（Adverse effect, AE）。該草案正在行業(yè)內(nèi)征求反饋意見，這一新指南草案一旦定案成文，為未來細胞和基因治療產(chǎn)品的早期開發(fā)速度和效率的提高有很大幫助。

盡管AAV基因治療仍存在很多挑戰(zhàn)和局限，但現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)表明AAV基因治療仍是一種安全、耐受性好和有效的方式。比如本文開頭提到的ADVM-022治療DME的試驗中發(fā)現(xiàn)存在高劑量毒性，但在低劑量試驗中沒有發(fā)現(xiàn)不良事件，而且ADVM-022的另一項治療濕性AMD的臨床試驗顯示，低劑量與高劑量應(yīng)用患者中均未觀察到類似不良事件，這些患者的隨訪已達到治療后52周至2.5年。

在全世界范圍內(nèi)，rAAV占總基因治療產(chǎn)品的24%，在2015-2020年之間，F(xiàn)DA已收到99個rAAV基因治療的IND。隨著各項技術(shù)的進步和臨床監(jiān)管的完善，我們期待更多的基因治療產(chǎn)品上市，惠及更多的常見眼部疾病患者，帶來長久的治療益處。

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4. Beginner’s guide to the production of AAV vectors for gene therapy–Mentored by a CDMO.https://biovian.com/beginners-guide-to-the-production-of-aav-vectors-for-gene-therapy-mentored-by-a-cdmo/

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